O protagonista de Snake Eater, Naked Snake, é um ex-agente da CIA e das Forças Especiais dos Estados Unidos (Boinas Verdes). Durante a missão, Major Zero, um ex-membro do Serviço Aéreo Especial, ajuda Snake ao dar conselhos para a missão e táticas de batalha. Para-Medic e Sigint dão conselhos especializados sobre fauna e flora, e equipamentos e armas, respectivamente.

Os dois principais antagonistas do jogo são o Coronel Volgin, um coronel da GRU(pronuncia-se: "gril") que possui um dispositivo controlador de eletricidade e membro da facção extrema de Brezhnev, que tenta tirar Nikita Khrushchev do poder para empossar Leonid Brezhnev e Alexey Kosygin,[nota 1] e The Boss, ex-mentora de Naked Snake.Além disso, a Unidade Cobra, uma unidade de Forças Especiais liderada por The Boss, possui membros que atuam como os chefes no jogo. A unidade é composta por The End, um experiente atirador de elite conhecido como o "pai do sniping moderno" The Fear, que possui flexibilidade e agilidade sobrenaturais; The Fury, um desfigurado ex-astronauta armado com um lança-chamas e um jetpack The Pain, que pode controlar vespas para defender-se e atacar e The Sorrow, o espírito de um falecido médium.

Outros personagens incluem Sokolov, um cientista de foguetes a quem Snake deve resgatar; EVA, uma desertora estado-unidense e aparente agente da KGB enviada para auxiliar Snake; e um jovem Ocelot, comandante da unidade "Ocelot", dentre a facção da GRU de Volgin.[nota 4] Algumas referências paródicas também são feitas a jogos anteriores: Major Raikov, o amante afeminado de Volgin, faz paródia da aparência andrógena muito criticada do protagonista de Metal Gear Solid 2: Sons of Liberty, Raiden; e o avô do atrapalhado soldado recorrente Johnny Sasaki faz uma participação como um sentinela de prisão.